細胞周期檢測的實驗原理和方法

細胞周期是指細胞從上一次分裂完成開始，到下一次分裂完成時為止，包括兩個階段：分裂間期和分裂期。細胞周期檢測的是單個細胞的增殖速度，通過縮時攝影來測定。

一、實驗原理

細胞在不同的時期，細胞所含的DNA量不同。正常細胞的二倍體含量通常為2N，則在G/G1期，細胞的DNA量為2N，而G2M期細胞DNA含量為4N。S期DNA量為2N-4N。碘化丙錠(PI)可以與細胞內的DNA和RNA結合，通過RNA酶將RNA消化后，檢測到與DNA結合的P熒光強度可以直接反映細胞內DNA含量的多少。因此，采用流式細胞術PI染色法檢測細胞內DNA含量時，可將細胞周期分為G/G1期、S期和G2/M期，并通過特殊軟件計算各時相的百分比。

二、實驗方法

測定細胞周期的方法常見的有同位素標記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。

1.同位素標記法

標記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百分數(shù)的辦法來測定細胞周期。

檢測原理：

① 待測細胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標記后，所有 S 期細胞均被標記。

② S 期細胞經(jīng) G2 期才進入 M 期，所以一段時間內 PLM = 0。

③ 開始出現(xiàn)標記 M 期細胞時，表示處于 S 期最后階段的細胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時間間隔為 G2期的持續(xù)時間。

④ S 期細胞逐漸進入 M 期，PLM 上升，到達到最高點的時候說明來自處于 S 最后階段的細胞，已完成 M，進入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達到最高點 (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續(xù)時間。

⑤ 當 PLM 開始下降時，表明處于 S 期最初階段的細胞也已進入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續(xù)時間。

2.流式細胞儀 PI 染色法

細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細胞在分裂結束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執(zhí)行一定生物學功能 ( G0 期 )。

檢測原理：

由于細胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細胞的 G1 / G0 期具有二倍體細胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結合，其熒光強度直接反映了細胞內 DNA含量。因此，通過流式細胞儀 PI 染色法對細胞內 DNA 含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

3.基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細胞處在細胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細胞周期的進程。FUCCI 技術建立在鑒定過表達的兩種調節(jié)細胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團 AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細胞周期的變化而不斷波動：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結果體現(xiàn)為表達 FUCCI 細胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現(xiàn)綠色。

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