【干貨】一文了解vero細(xì)胞培養(yǎng)全流程

Vero細(xì)胞系是連續(xù)非整倍體細(xì)胞，連續(xù)細(xì)胞系可以經(jīng)過(guò)多次分裂而不衰老，非整倍體是指細(xì)胞中的染色體數(shù)目與通常的不同。與其它普通哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同，Vero細(xì)胞還有干擾素分泌缺陷的特點(diǎn)，當(dāng)被病毒感染時(shí)，它不能分泌干擾素，但它仍然具有α/β-干擾素的受體，所以對(duì)于其它來(lái)源的干擾素仍有正常的反應(yīng)。

一、基本信息

細(xì)胞名稱(chēng)：Vero非洲綠猴腎細(xì)胞

細(xì)胞別稱(chēng)：VERO; Verda reno

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

組織來(lái)源：正常腎

培養(yǎng)基：MEM+10%FBS+1%PS

生長(zhǎng)條件：

①氣相：95%空氣+5%二氧化碳；

②溫度：37℃

傳代方法：1:2至1:3，每周2-3次。

二、培養(yǎng)指南

1. Vero細(xì)胞復(fù)蘇步驟

(1)將1mL Vero細(xì)胞懸液凍存管于37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基進(jìn)行混合均勻；

(2)在1000rpm條件下離心4min，棄上清液，再加入1-2mL培養(yǎng)基后輕輕吹打混勻；

(3)將Vero細(xì)胞懸液加入到含有適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入到6cm皿中，加入約4mL的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）；

(4)第二天換液并觀察Vero細(xì)胞密度。

2. Vero細(xì)胞傳代步驟

Vero細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

(1)1mL Vero猴腎細(xì)胞懸液凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻；

(2)在1000rpm條件下離心4min，棄上清液，再加入1-2mL培養(yǎng)基后吹打混勻；

(3)將Vero猴腎細(xì)胞胞懸液加入到含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入到6cm皿中，加入約4mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）；

(4)第二天換液并觀察Vero細(xì)胞密度。

3. Vero細(xì)胞凍存步驟

Vero細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。以T25瓶為例：

(1)收集Vero細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，于1000rpm條件下離心4min，棄上清液，用PBS清洗一遍，棄掉PBS后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(2)根據(jù)Vero細(xì)胞數(shù)量對(duì)應(yīng)加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度在5×106~1×107/mL之間，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管上做好標(biāo)識(shí)。

(3)將凍存管放入-80℃冰箱中，24h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。

三、注意事項(xiàng)

1. 培養(yǎng)基不能回收使用

灌液培養(yǎng)基不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的wan全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 細(xì)胞到貨處理說(shuō)明

(1)收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。

(2)觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h。

(3)收到Vero細(xì)胞后第一次傳代建議1:2傳代，1:2傳代是指1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿，而不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

四、常見(jiàn)問(wèn)題

1. vero細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點(diǎn)？

處理方法：在細(xì)胞消化離心棄上清后，使用PBS重懸洗滌，在750rpm條件下低速離心4min，重新鋪下，然后鏡下觀察是否干凈。

2. vero細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)慢？

(1)更換不同培養(yǎng)基或血清導(dǎo)致

解決方法：分析新培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的成分，比較新血清與原血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)基。

(2)有少量細(xì)菌或真菌污染

解決方法：用含抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，盡量丟棄培養(yǎng)物。

(3)試劑保存不當(dāng)導(dǎo)致

解決方法：血清需要保存在-10到-20℃；

培養(yǎng)基需在2-8℃避光保存；

含血清wan全培養(yǎng)液在2-8℃保存。

(4)接種細(xì)胞起始濃度太低

解決方法：增加接種細(xì)胞起始濃度。

(5)細(xì)胞已老化

解決方法：引入新的保種細(xì)胞，重新培養(yǎng)。

(6)支原體污染

解決方法：吸取部分培養(yǎng)基，離心得上清，檢測(cè)支原體；

清潔支架和培養(yǎng)箱；

可在培養(yǎng)皿里加入支原體去除劑清除；

如發(fā)現(xiàn)支原體污染，建議盡量丟棄。

3. vero細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不貼壁？

(1)胰酶消化過(guò)度導(dǎo)致

解決方法：嘗試縮短胰酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。

(2)支原體污染

解決方法：吸取培養(yǎng)2-3的培養(yǎng)基，檢測(cè)支原體；

清潔支架和培養(yǎng)箱；

 如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

(3)培養(yǎng)基pH值過(guò)堿（NaHCO3分解）

解決方法：使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2。

(4)細(xì)胞老化

解決方法：購(gòu)買(mǎi)新的代數(shù)較低的細(xì)胞。

(5)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

解決方法：調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

4. vero細(xì)胞用什么培養(yǎng)基？

vero細(xì)胞培養(yǎng)基：MEM+10%FBS+1%P/S

5. vero細(xì)胞DMSO凍存比例？

凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配或無(wú)血清細(xì)胞凍存液。

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