一抗和二抗如何選擇？

一、一抗的有關(guān)介紹

1. 概念

   一抗（primary antibody）作為一種免疫球蛋白，能夠特異性結(jié)合特定蛋白并將其純化、檢測和定量。使用小鼠、大鼠、山羊、兔子以及其他動物作為寄主，可將一抗培育成多克?。╬Ab）或單克隆抗體（mAb）。
   

2. 實驗中的考慮因素

   （1）實驗種屬和類型的確定

         ※明確實驗中的樣本種屬：如人、鼠、兔等，應(yīng)該選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體。

         ※明確實驗類型：如WB、ELISA、IHC、ICC、FCM 分析等，一般抗體說明書會明確說明該抗體經(jīng)試驗驗證適用或不適用于何種分析類型，如未提及也并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗驗證。

   （2）抗體的類型

        ※單克隆抗體：由單一B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生的僅識別某一特定抗原表位的、高度均一的抗體。單抗實驗過程中可產(chǎn)生極少或無背景染色，同時也可減少與非目的蛋白的交叉反應(yīng)。

        ※多克隆抗體：由多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，針對于抗原幾個表位的多種抗體混合物。多抗可識別出抗原的微小變異，能產(chǎn)生更強(qiáng)大的抗原檢測信號，是涉及變性蛋白質(zhì)實驗首xuan抗體。

3. 分析樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

   選擇最合適的抗體還需要分析了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，抗體說明書中也有相關(guān)免疫原的描述。如檢測的是蛋白片段或者特殊的同型物又或是蛋白全長的某一個區(qū)域，那么則必須選擇用含有此片段域的免疫原制備的抗體。
   

4. 抗體宿主物種的選擇

   一般在用偶聯(lián)的二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇就較為重要。對于IHC而言，應(yīng)盡可能得選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而可以避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的交叉反應(yīng)。比如：檢測小鼠樣本蛋白，則不要選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選擇兔源的一抗，那二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。

   如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除IHC外的其它不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大。

二、二抗的有關(guān)介紹

1. 概念

   二抗（secondary antibody）可以直接和與靶抗原連接的一抗結(jié)合。在一抗與抗原結(jié)合后，標(biāo)記的二抗特異性的結(jié)合一抗的Fc端。利用這種相互作用可以使二抗間接地進(jìn)行檢測和純化靶蛋白（抗原）。
   

2. 實驗中的考慮因素

   （1）種屬來源
   

    一般會根據(jù)一抗的種屬來源來選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。比如：一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則應(yīng)該是抗小鼠的二抗（山羊或是兔抗小鼠）。

   （2）抗體亞型

         多克隆抗體一般主要是IgG類免疫球蛋白，相應(yīng)的二抗為抗IgG抗體；單克隆抗體由于存在不同的亞型和類別，選擇二抗時需要根據(jù)一抗的類型或亞類相匹配。

   二抗又分為完整抗體和抗體片段兩種，根據(jù)實驗來決定使用哪種，主要包括IgG分子完整抗體、Fab片段以及F(ab’)2片段。

   tips:

      ※較小的抗體片段能夠更高效地滲透組織，有利于IHC及IF等實驗應(yīng)用；

      ※采用抗體片段可以減少抗體Fc 部分與細(xì)胞上Fc受體之間的非特異性結(jié)合，可用于分析Fc受體含量高的特定組織（例如脾）。

   （3）種屬來源

         二抗的選擇還與偶聯(lián)的標(biāo)記物有關(guān)系，二抗可以偶聯(lián)不同的標(biāo)記物如酶、熒光素、生物素及同位素等，形成不同的標(biāo)記抗體。

         偶聯(lián)物的選擇會對抗體靈敏度產(chǎn)生極大的影響；生物素偶聯(lián)物、聚合物的酶促偶聯(lián)物或熒光偶聯(lián)物有利于放大信號。