轉(zhuǎn)染技術(shù)要點(diǎn)

　　1. 細(xì)胞培養(yǎng)物 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。低的細(xì)胞代數(shù)(<50)能確保基因型不變。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專(zhuān)門(mén)的說(shuō)明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。
 

　　2. 血清大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清(FCS)經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)(轉(zhuǎn)右) 試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照(不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA)以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。
 

　　3. 載體構(gòu)建 轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建(病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問(wèn)題(如基因污染)。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線(xiàn)性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。
 

　　4. DNA質(zhì)量 DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化**品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。此外，對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞(如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞)，QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過(guò)程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。
 

　　5.轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。