細(xì)胞凋亡的早期檢測方法有哪些？

1、PS（磷脂酰絲氨酸）在胞外膜分布的檢測
PS從胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)現(xiàn)象是在細(xì)胞凋亡的早期即可發(fā)生標(biāo)志。AnnexinV是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在胞膜外側(cè)的PS，使用熒光素標(biāo)記的AnnexinV 蛋白（如Annexin V-FITC）即可檢測細(xì)胞凋亡。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。操作簡便快速，10分鐘就可完成檢測。靈敏度高，可作為流式方法分析凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。

2、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測
正常狀態(tài)下,谷胱甘肽（GSH）作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而清除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被消化除。在細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。

3、細(xì)胞色素C的檢測
細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，而不存在于胞漿內(nèi)。凋亡信號刺激后可使其從線粒體釋放到胞漿中，結(jié)合Apaf-1后而啟動caspase級聯(lián)活化反應(yīng)，先可激活caspase-9，后者再激活caspase-3和下游的其它c(diǎn)aspase分子。凋亡發(fā)生的早期，細(xì)胞色素C泄漏到胞漿中，檢測胞漿中細(xì)胞色素c的含量可反映細(xì)胞的早期凋亡。

4、線粒體膜電位變化的檢測
在細(xì)胞凋亡的早期，線粒體在形態(tài)學(xué)上沒有明顯變化。但線粒體可發(fā)生很多生理生化的改變。例如在受到凋亡誘導(dǎo)后，線粒體的轉(zhuǎn)膜電位發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性改變。MitoSensorTM是一種陽離子染色劑，對此膜電位改變非常敏感，可呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體跨膜電位改變，它則以單體形式停留于胞漿中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。